先天性巨结肠是由于肠壁缺乏神经节细胞，导致肠管的持续痉挛，粪便淤滞于近端的结肠，导致近端结肠的肥厚、扩张。首选的最简单的检查就是腹部的X片，可以做腹部的立卧位平片，通常可以看到低位不全性的肠梗阻，以及近端的结肠扩张，盆腔无气体或者有少量的气体。

其次可以做钡灌肠检查，诊断率在90%左右，可以显示典型的肠痉挛以及呈漏斗状的改变。另外，也可以做直肠肛门测压检查。最后，诊断先天性巨结肠的金标准就是做直肠黏膜的活检，可以取距肛门齿状线3cm以上直肠组织，病理检查发现该段肠管有异常增生的神经纤维束，但缺乏神经节细胞，这时就可以明确诊断先天性巨结肠症了。